基因組編輯技術(shù)可以定向修飾植物基因組，從而大大加速植物育種的進(jìn)程，是實(shí)現(xiàn)作物精準(zhǔn)育種的重要技術(shù)突破。然而，作物的許多重要農(nóng)藝性狀是由基因組中的單個(gè)或少數(shù)核苷酸的改變或突變?cè)斐傻?。基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因組編輯，可利用外源修復(fù)模板通過同源重組介導(dǎo)的修復(fù)方式（HDR）實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因特定核苷酸的改變。目前，同源重組在植物中的效率非常低，很難以此方式實(shí)現(xiàn)高效、穩(wěn)定的植物基因組的精準(zhǔn)編輯。CRISPR系統(tǒng)所衍生的胞嘧啶和腺嘌呤堿基編輯器，可以分別在基因組靶向位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)C:G>T:A或A:T>G:C的堿基替換。然而，堿基編輯技術(shù)還不能實(shí)現(xiàn)其它類型的堿基替換(C:G>A:T和A:T>C:G)及堿基轉(zhuǎn)換(C:G>G:C和A:T>T:A)，更不能實(shí)現(xiàn)片段的精準(zhǔn)插入和刪除。因此，植物育種和基因功能研究迫切需要可以高效、精準(zhǔn)實(shí)現(xiàn)任意堿基替換、增添或刪除的基因組定向編輯技術(shù)體系。
　　哈佛大學(xué)教授David R. Liu研究團(tuán)隊(duì)在哺乳動(dòng)物中開發(fā)了全新的基因組引導(dǎo)編輯（Prime Editing）系統(tǒng)。該系統(tǒng)由nCas9（H840A）融合逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）和pegRNA（prime editing guide RNA)）兩部分組成。pegRNA通過在sgRNA骨架的3’端引入PBS序列（Primer binding site)結(jié)合到nCas9斷裂的非靶標(biāo)鏈上，逆轉(zhuǎn)錄酶根據(jù)其攜帶的RT模板逆轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的含有目的突變的單鏈DNA。細(xì)胞進(jìn)一步通過DNA損傷修復(fù)把目的突變引入基因組。此外，在Cas9非靶標(biāo)鏈上引入能在產(chǎn)生缺刻的nicking sgRNA，有助于提升引導(dǎo)編輯的效率。近日，中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞研究組與David R. Liu研究組合作成功建立并優(yōu)化了適用于植物的引導(dǎo)編輯系統(tǒng)（Plant Prime Editing，PPE），并在重要農(nóng)作物水稻和小麥基因組中實(shí)現(xiàn)精確的堿基替換、增添或刪除。
　　研究人員首先通過PPE系統(tǒng)在水稻和小麥原生質(zhì)體中實(shí)現(xiàn)了16個(gè)內(nèi)源位點(diǎn)的精準(zhǔn)編輯，包括12種類型的單堿基替換、多堿基替換、小片段的精準(zhǔn)插入和刪除，編輯效率最高可達(dá)19.2%。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該系統(tǒng)的編輯效率受到PBS和/或RT模板長度以及nicking sgRNA位置的影響。研究人員對(duì)PPE系統(tǒng)進(jìn)行了一系列的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)37℃條件下培養(yǎng)可以顯著提升該系統(tǒng)的編輯效率(1.6倍)，通過引入核酶對(duì)pegRNA進(jìn)行自加工，也可以在部分位點(diǎn)提高編輯效率。此外，來源于植物花椰菜花葉病毒和大腸桿菌retron系統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄酶可以與nCas9融合在植物中實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)引導(dǎo)編輯。最后，研究人員通過PPE成功獲得了單堿基突變、多堿基突變及精準(zhǔn)刪除的水稻突變體植株，效率最高可達(dá)21.8%，這些突變均難以通過現(xiàn)有的基因編輯系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。雖然Plant Prime Editing系統(tǒng)在部分位點(diǎn)上C:G>T:A或A:T>G:C的效率低于單堿基編輯系統(tǒng)，但是該系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)所有類型的堿基置換，以及堿基增加和刪除。PPE極大地?cái)U(kuò)展了植物基因組編輯范疇，為植物基因組功能解析及實(shí)現(xiàn)作物精準(zhǔn)育種提供了重要技術(shù)支撐。
　　研究成果于3月16日在線發(fā)表于Nature Biotechnology 雜志（DOI:10.1038/s41587-020-0455-x）。遺傳發(fā)育所高彩霞研究組博士生林秋鵬、博士后宗媛以及博士生薛郴銷為該論文的共同第一作者，高彩霞為論文的通訊作者。高彩霞研究組的研究得到國家自然科學(xué)基金、中科院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃的資助。
　　圖: 植物基因組引導(dǎo)編輯系統(tǒng)（PPE）可精準(zhǔn)編輯植物基因組。(a) PPE編輯系統(tǒng)工作原理示意圖。(b) 熒光報(bào)告系統(tǒng)比較不同PPE編輯系統(tǒng)工作效率。(c) PPE編輯系統(tǒng)可在多個(gè)內(nèi)源位點(diǎn)上產(chǎn)生12種類型的單堿基變換，以及多堿基變換和小片段增刪。